Explorador y conquistador, zarpa de Sanlúcar de Barrameda en 1535 en la expedición de Pedro Fernández de Lugo, con el titulo de Teniente Gobernador. A su llegada organiza una expedición junto a su hermano Hernán, al mando de 600 hombres, llegando a la sierra de Santa Marta siguiendo el cauce del rio Magdalena con varias naves. Fundó la ciudad de Santa Fe de Bogotá en 1538.

Permanecerían en la zona durante un año hasta que llegaron las expediciones de Sebastián de Belalcázar procedente de Ecuador y Nicolás Federman procedente de Venezuela. Reunidos los tres jefes de las expediciones decidieron que fuese la corona quien dijera a quien pertenecía aquellos territorios, Quesada los bautizo con el nombre de Nuevo Reino de Granada. Se trasladaron a Cartagena de Indias de donde embarcaron hacia España llegando a Sanlúcar de Barrameda en 1539, Belalcázar conseguiría la gobernación de Popayán, mientras Quesada volvería a embarcar en Sanlúcar 10 años después en 1549, con el título de gobernador de El Dorado, mandaría otra expedición en busca de aquella mítica tierra que sería un fracaso, moriría en 1579.