Durante la preparación del segundo viaje, la flota de Colón se encontraba en Sanlúcar de Barrameda y por la premura de tiempo para zarpar, la flota pasó a la bahía de Cádiz de donde finalmente zarparía.
Seis navíos y unos 220 tripulantes componían la flota del tercer viaje colombino. Tras pertrechar la flota, en el puerto de Bonanza, levo anclas de Sanlúcar de Barrameda el 30 de mayo de 1498. Desde Canarias siguió rumbo a las islas portuguesas de Cabo Verde, en este viaje navegaría más al sur que los anteriores, llegando a finales de julio de 1499 a descubrir la isla de Trinidad, prosiguiendo el viaje, recorrió la costa de la península de paria (en Venezuela), tocando por primera vez el continente americano. Cuando enfilaba el camino de la isla de La Española encontró isla Margarita, en la que pudo comprobar que sus habitantes pescaban gran cantidad de perlas. El 30 de agosto llegó a la nueva capital de las indias, Santo Domingo, que había sido fundada en 1496 por su hermano Bartolomé en el sur de la isla.


La situación en la que encontró a los colonizadores españoles era grave, la mayoría de ellos se habían rebelado contra la autoridad de los Colón, a las órdenes de Francisco Roldan. Las quejas contra la familia Colón, se vieron agravadas por la forma de proceder que tenían, los cuales, habían ocultado el criadero de perlas de isla Margarita y otras islas cercanas, estas quejas, llegaron a la corte y los Reyes decidieron destituirlos.
Enviando los reyes a Francisco de Bobadilla como juez pesquisidor, llegando a Santo Domingo el 23 de agosto de 1500 para sustituir al virrey y gobernador Cristóbal Colón. Hubo alguna resistencia por parte de los Colón, lo que explica la forma de actuar de Bobadilla, quien a primeros de octubre de 1500, envió a España a Cristóbal, Bartolomé y Diego Colón, cargados de cadenas, llegando a este puerto de Sanlúcar en noviembre de 1500. Los Reyes Católicos sintieron el mal trato dado a Colón, pero aunque fuese mucho el desagravio no le devolvieron sus privilegios perdidos, prometiéndoles que lo harían mientras le encargaron el cuarto viaje.


Durante el mes de abril de 1502 Cristóbal Colón esperaba en Sanlúcar la llegada de su hermano Bartolomé procedente de Sevilla con cuatro carabelas, para iniciar su cuarto y último viaje, de aquí pasaron a la bahía de Cádiz de donde zarparon, regresando a Sanlúcar el 7 de noviembre de 1504. Moriría el 20 de mayo de 1506.
Muchas fueron las veces que este gran navegante y descubridor del continente americano estuvo en Sanlúcar de Barrameda. Sirva de ejemplo, que de sus cuatro viajes al Nuevo Mundo en cinco ocasiones tanto a la salida como a la llegada embarcó y desembarcó en esta ciudad.