Considerado un hombre culto, era bachiller cuando pasó a las Indias desde Sanlúcar con Nicolás de Ovando en 1502.

Durante la gobernación de Ovando, se unió a las tropas españolas contra los indígenas de la zona, y disfrutó de buenos repartimientos de indios, gozando de buena posición en la isla, regresando a España en 1510 por mandato del gobernador Diego Colón.

En 1512 regresó a Santo Domingo, embarcando en Sanlúcar, a su llegada fue enviado a cuba, para participar en la conquista a las órdenes de Diego Velázquez. Seria enviado en 1520 en en auxilio de Hernán Cortés que se enfrentaba a las tropas de Pánfilo de Narváez para tratar de impedir el choque entre ambos, pero decidió unirse a Narváez siendo un estorbo para este, haciéndole volver a Santo Domingo.

En 1522 se le ordenó unirse a la expedición comandada por Francisco Gordillo, que desembarcó en el cabo Fear, en la costa atlántica de la actual Carolina del Norte en 1523, habían recibido instrucciones del el emperador Carlos I para buscar el paso del noroeste hacia las islas Molucas. Recorrería las costas de los actuales estados de : Virginia y Carolina del Norte.

En 1524, tras recibir del emperador Carlos I derechos sobre las tierras descubiertas, organizó una expedición de 700 hombres y mujeres para colonizar la costa del actual estado de Virginia, donde fundó San Miguel de Guadalupe, primera colonia europea en Norteamérica, pero tras varios meses de penuria y sin poder realizar intercambio con los indígenas de la zona para conseguir alimentos, Ayllón mando levantar el asentamiento y dirigirse de nuevo a la isla La Española, de los 700 que le acompañaron sólo regresaron 180, diciendo que habían sufrido, hambre, enfermedades y ataques de los indígenas locales, declarando que Vázquez de Ayllón había fallecido antes de regresar.