Explorador y gran marino acompañó al Virrey de Nueva España Antonio de Mendoza, embarcando en Sanlúcar de Barrameda en julio de 1535. Recibiría en 1541 el encargo de Antonio de Mendoza y Pacheco, de capitanear una expedición hacia las Molucas, buscando nuevas rutas comerciales. Zarparía del puerto mejicano de Navidad el 1 de noviembre de 1542, con seis naves y 400 hombres, siendo esta expedición la que dio nombre a las islas Filipinas, en honor de Felipe II. La misión principal de Villalobos era establecerse en las islas e intentar el comercio desde allí con China y Japón, además de con las islas de las especias, en manos de los portugueses. Descubriría un grupo de islas cerca de la costa mejicana llamadas Corrales, hoy San Benedicto, en enero de 1543, avistaron varias pequeñas islas llamadas Los Jardines, hoy las islas de Eniwetok y Ulithi, y avistadas en 1527 por Álvaro de Saavedra, también descubrieron la isla de Palaos que pertenecía al grupo de las Carolinas, que perteneció a España hasta finales del siglo XIX.

En enero de 1543 el piloto Ginés de Mafra, uno de los que regreso a Sanlúcar con Elcano en 1522 llegó a la isla de Mazahua, un lugar donde había estado con la expedición de Magallanes en 1521. Esta seria la segunda visita de Mafra a las Filipinas, en febrero entraron en la isla de Mindanao. Villalobos la llamó Cesárea Karoli en honor del emperador Carlos I, en marzo llegaron a la isla de Sarangani. En agosto apareció un contingente portugués les entregó una carta de Jorge de Castro, Gobernador de la Molucas, exigiendo una explicación para la presencia de la flota en territorio portugués. Villalobos respondió con una carta en la que decía que no habían invadido ningún territorio, mandaría uno de sus naves de regreso a Méjico, en septiembre llegaría otra carta de los portugueses, contestándole Villalobos igualmente que antes que ellos estaban en territorio de Castilla. En 1544 partieron hacia la isla de Ambon, mas tarde llegaron a las islas de Samar y Leyte, expulsados por los nativos, Villalobos se vio obligado a abandonar aquellas tierras refugiándose en las Molucas, siendo encarcelados por los portugueses.

Moriría Villalobos el 4 de abril de 1544 en la isla de Ambon en la prisión donde se encontraba, muchos miembros de la tripulación sobrevivieron, entre ellos de Mafra, quien redacto un manuscrito sobre la circunnavegación de Magallanes, uno de los que regreso a Lisboa y luego a Sanlúcar de Barrameda entrego el manuscrito de Mafra que opto por quedarse en aquellas tierras